pCMV-N-Flag是晶安生物自行研發的用于在哺乳動物細胞中表達N端和Flag tag(Flag標簽)融合的目的
蛋白的表達質粒。含有CMV啟動子可以高效啟動目的蛋白在細胞中的表達;在多克隆位點的5'端含有一個可以編碼Flag標簽的序列,因此可以表達出含有Flag標簽的融合蛋白,可以方便地使 用抗Flag的抗體來識別目的蛋白,有利于目的蛋白檢測和分離純化。質粒為卡那霉素抗性。轉染細胞后,可使用G418篩選穩定表達目的蛋白的細胞株。
pCMV-N-Flag質粒的主要信息如下:
Feature Nucleotide &nb sp; Position
CMV promoter &nb sp; 1–602
T3 promoter and T3 primer binding site 620–639
Flag tag &nb sp; 679–702
multiple cloning site 705 –778
T7 promoter and T7 primer binding site 821–842
SV40 polyA signal &nb sp; 854–1237
f1 origin of ss-DNA replication 1375–1681
bla promoter &nb sp; 1706–1830
SV40 promoter &nb sp; 1850–2188
neomycin/kanamycin resistance ORF 2223–3014
HSV-thymidine kinase(TK)polyA signal 3015–3473
pUC origin &nb sp; 3602–4269
pCMV-N-Flag質粒的圖譜如下:
pCMV-N-Flag的多克隆位點的詳細圖譜如下:
&nb sp; Flag tag
SacI M D Y K D D D D K
651 GAGCTCCACC GCGGTGGCGG CCGCCATGGA TTACAAGGAT GACGACGATA
CTCGAGGTGG CGCCACCGCC GGCGGTACCT AATGTTCCTA CTGCTGCTAT
XmaI PstI SmaI BamHI HindIII EcoRI EcoRV SalI BglII
701 AGAGCCCGGG CGGATCCAAG CTTCTGCAGG AATTCGATAT CGTCGACAGA
TCTCGGGCCC GCCTAGGTTC GAAGACGTCC TTAAGCTATA GCAGCTGTCT
XhoI XbaI ApaI
751 TCTCTCGAGT CTAGAACTAG TGGGCCCGGT ACCTTAATTA ATTAAGGTAC
AGAGAGCTCA GATCTTGATC ACCCGGGCCA TGGAATTAAT TAATTCCATG
pCMV-N-Flag中沒有的酶切位點(Restriction enzymes that do not cut pCMV-N-Flag)包括:
Afl II Age I Ahd I Asc I Bbs I Bbv II Blp I
Bsg I BsiW I BsmB I BspM II BsrG I BssH II Bst1107 I
BstE II Ear I Eco47 III Eco72 I EcoN I Esp I Fse I
Nru I PflM I Pme I Pml I PpuM I Psp1406 I Sap I
Sca I Spl I
pCMV-N-Flag中的單酶切位點(Restriction enzymes that cut pCMV-N-Flag once)包括:
Nde I CA`TA,TG 241
SnaB I TAC|GTA 347
Nhe I G`CTAG,C 598
Sac I G,AGCT`C 656
Sac II CC,GC`GG 663
BstX I CCAN,NNNN`NTGG 664
Not I GC`GGCC,GC 669
PspA I C`CCGG,G 706
Xma I C`CCGG,G 706
Srf I GCCC|GGGC 708
Sma I CCC|GGG 708
BamH I G`GATC,C 713
Hind III A`AGCT,T 719
Pst I C,TGCA`G 729
EcoR I G`AATT,C 731
EcoR V GAT|ATC 739
Sal I G`TCGA,C 743
Acc I GT`MK,AC 744
Bgl II A`GATC,T 749
PaeR7 I C`TCGA,G 755
Xho I C`TCGA,G 755
Xba I T`CTAG,A 761
Spe I A`CTAG,T 767
Bsp120 I G`GGCC,C 773
Apa I G,GGCC`C 777
Pvu I CG,AT`CG 855
Bcl I T`GATC,A 1009
Mun I C`AATT,G 1102
Hpa I GTT|AAC 1115
Mlu I A`CGCG,T 1238
Dra III CAC,NNN`GTG 1468
Sfi I GGCCN,NNN`NGGCC 2127
BseR I GAGGAG 16/14 2170
Stu I AGG|CCT 2173
Cla I AT`CG,AT 2192
Kas I G`GCGC,C 2351
Nar I GG`CG,CC 2352
Ehe I GGC|GCC 2353
Bbe I G,GCGC`C 2355
Msc I TGG|CCA 2434
Tth111 I GACN`N,NGTC 2470
BsrD I GCAATG, 8 2585
Bsp1286 I G,DGCH`C 2655
Rsr II CG`GWC,CG 2868
BsiC I TT`CG,AA 3034
BstB I TT`CG,AA 3034
Bsa I GGTCTC 7/11 3341
HgiE II ACCNNNNNNGGT-1/13 3681
ApaL I G`TGCA,C 3956