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一、 复苏

●1. 把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

●2. 把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。

●3. 把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

●4. 标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。

●5. 3天换一次培养基。

二、 传代

●1. 培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

●2. 把原有培养基吸掉。

●3. 加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。

●4. 细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。

●5. 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。

●6. 把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

●7. 倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。

●8. 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。

三、 冻存把细胞消化下来并离心（同上）。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。 冻存液的配制： 70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。